Porque Las Bacterias Se Vuelven Resistentes A Los Antibióticos?

¿Cómo contribuye el tomar antibióticos a la resistencia a estos medicamentos? – Cada vez que se usan antibióticos, estos pueden contribuir a la resistencia. Esto es porque los aumentos en la resistencia a los antibióticos están determinados por una combinación de microbios expuestos a los antibióticos, y la propagación de esos microbios y sus mecanismos de resistencia.

1. Cuando se necesitan antibióticos, los beneficios por lo general superan los riesgos de que lleven a la resistencia a este tipo de medicamentos.
2. Sin embargo, demasiados antibióticos se están usando en forma innecesaria e incorrecta, lo cual amenaza la utilidad de estos importantes medicamentos.
3. Por ejemplo, en los Estados Unidos se recetan demasiados antibióticos innecesariamente a las personas.

Los CDC estiman que, en los consultorios médicos y las salas de emergencia, se recetan cada año aproximadamente 47 millones de tratamientos con antibióticos para infecciones que no los necesitan, como los resfriados y la influenza. Esto representa aproximadamente el 30 % de todos los antibióticos que se recetan en estos entornos.

¿Por qué las bacterias se hacen resistentes a los antibióticos?

Los antibióticos son medicamentos utilizados para prevenir y tratar las infecciones bacterianas. La resistencia a los antibióticos se produce cuando las bacterias mutan en respuesta al uso de estos fármacos. Son las bacterias, y no los seres humanos ni los animales, las que se vuelven resistentes a los antibióticos.

• Estas bacterias farmacorresistentes pueden causar infecciones en el ser humano y en los animales y esas infecciones son más difíciles de tratar que las no resistentes.
• La resistencia a los antibióticos hace que se incrementen los costos médicos, que se prolonguen las estancias hospitalarias y que aumente la mortalidad.

Es necesario que se cambie urgentemente la forma de prescribir y utilizar los antibióticos. Aunque se desarrollen nuevos medicamentos, si no se modifican los comportamientos actuales, la resistencia a los antibióticos seguirá representando una grave amenaza.

¿Cómo las bacterias crean resistencia?

La aparición de la resistencia en una bacteria se produce a través de mutaciones (cambios en la secuencia de bases de cromosoma) y por la trasmisión de material genético extracromosómico procedente de otras bacterias. En el primer caso, la resistencia se trasmite de forma vertical de generación en generación.

¿Cuál es la bacteria más resistente del mundo?

Patógenos multirresistentes que son prioritarios para la OMS

• Helicobacter pylori, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae y Salmonella spp son algunos de los microorganismos que en los últimos tiempos han demostrado mayores niveles de resistencia a diversas generaciones de antibióticos y que ponen en riesgo la salud de la población.
• Una lista que, desafortunadamente, crece cada vez más y que hace que hoy la resistencia antimicrobiana sea un problema de salud pública, calificado en 2020 por la Organización Mundial de la Salud (OMS) dentro de la lista de “problemas sanitarios urgentes de dimensión mundial”.
• Las causas, dice la OMS, obedecen a “una miríada de factores que se han combinado para crear un coctel terrorífico, como la prescripción y utilización no reglamentadas de antibióticos, la falta de acceso a medicamentos de calidad a precio asequible; la falta de agua limpia y de servicios de saneamiento, y de prevención y control de infecciones”.
• Sin embargo, aunque la situación se hace más crítica en regiones marginadas y de pobreza, con crisis sanitarias, falta de agua y hábitos e higiene inadecuados, se han encontrado preocupantes niveles de resistencia a algunas infecciones bacterianas tanto en países de ingresos bajos, como medianos y altos; en hombres y en mujeres, sin importar edad, raza ni condición social, por lo que se trata de una problemática global.

Por ejemplo, un estudio liderado por expertos del Sistema Mundial de Vigilancia de la Resistencia a los Antimicrobianos (GLASS, por sus siglas en inglés), respaldado por la OMS, reveló la presencia generalizada de resistencia a los antibióticos en muestras de 500.000 personas de 22 países, en quienes se sospechaban infecciones bacterianas, con un amplia variación desde un 0% hasta un 82% en al menos uno de los antibióticos más utilizados.

1. ¿Cuáles son esos patógenos prioritarios?
2. La lista de patógenos prioritarios para la OMS se elaboró con el apoyo de la División de Enfermedades Infecciosas de la Universidad de Tübingen (Alemania), “mediante una técnica de análisis de decisiones de múltiples criterios desarrollada por un grupo de expertos internacionales”.
3. El objetivo es que estos resultados sean tenidos en cuenta y se consideren clave en los proyectos de investigación, desarrollo e innovación (I+D) de nuevos antibióticos.
4. Los criterios para incluir patógenos en la lista fueron los siguientes, explica la OMS: El grado de letalidad de las infecciones que provocan; el hecho de que el tratamiento requiera o no hospitalización prolongada; la frecuencia con que presentan resistencia a los antibióticos existentes; la facilidad con la que se transmiten entre animales, de animales a personas y entre personas; si las infecciones que provocan pueden o no prevenirse (por ejemplo, mediante una buena higiene y vacunación); cuántas opciones terapéuticas quedan; y si se están investigando y desarrollando nuevos antibióticos para tratar las infecciones que causan.
5. En la lista de prioridad crítica se incluyen bacterias multirresistentes especialmente peligrosas en hospitales, hogares de cuidado crónico y entre pacientes que necesitan ser atendidos con dispositivos invasivos como ventiladores y catéteres intravenosos.
6. En los niveles de prioridad elevada y media, se incluyen bacterias cuya farmacorresistencia va en ascenso y que están relacionados, en muchos casos, con enfermedades adquiridas en la comunidad, como la gonorrea o las intoxicaciones alimentarias por Salmonella. Veamos:
7. Prioridad 1: CRÍTICA

– Acinetobacter baumannii resistente a carbapenémicos: Clasificado como uno de los seis más importantes microorganismos Gram-negativos multirresistentes a nivel mundial. Causa infecciones, principalmente adquiridas en el hospital, que comprometen pulmones, sangre e infecciones posquirúrgicas.

Puede causar brotes hospitalarios. – Pseudomonas aeruginosa resistente a carbapenémicos: Tiene la capacidad de generar resistencia a todos los antibióticos, incluyendo las nuevas moléculas. Se asocia principalmente a infecciones en la sangre, los pulmones, las vías urinarias y las heridas quirúrgicas.

Con elevada mortalidad. – Enterobacterales resistentes a carbapenémicos y productoras de β-lactamasas de espectro extendido BLEEs: Son los microorganismos más frecuentemente aislados en unidades de cuidados intensivos en Latinoamérica. A pesar de nuevos medicamentos disponibles para su manejo, ya se encuentra resistencia emergente y combinaciones de diversas enzimas, lo que limita las opciones terapéuticas.

1. Se asocian a elevada mortalidad.
2. Prioridad 2: ELEVADA – Enterococcus faecium resistente a Vancomicina : Responsable de infecciones como endocarditis, infecciones urinarias e intraabdominales asociadas a peritonitis terciarias.
3. Puede causar brotes a nivel hospitalario.
4. Staphylococcus aureus resistente a la meticilina y con sensibilidad disminuida a la vancomicina: Se asocia a infecciones de la piel y tejidos blandos, osteomielitis, neumonías adquiridas en comunidad y en el hospitaly endocarditis.

A pesar de las opciones terapéuticas disponibles puede causar infecciones refractarias al tratamiento de alta mortalidad. – Helicobacter pylori resistente a claritromicina: Se asocia a ulcera gástrica, gastritis crónica, linfoma tipo MALT y cancer gástrico.

– Campylobacter spp resistente a fluoroquinolonas: Se relaciona con diarrea del viajero y causa infecciones gastrointestinales invasivas. Además de la resistencia creciente a los antibióticos, su diagnóstico es complejo, pues necesita requerimientos específicos para cultivo. – Salmonella spp resistente a fluoroquinolonas : Se asocia con diversas infecciones desde leves a severas y relacionadas con animales mascota (tortugas) y alimentos contaminados (cárnicos, aguas y lácteos).

La resistencia en las Salmonellas no tifoideas va en aumento en Latinoamérica. – Neisseria gonorrhoeae resistente a cefalosporinas y fluoroquinolonas: Es el agente causal de la gonorrea, una de las cuatro principales infecciones de transmisión sexual en el mundo.

La resistencia en este microorganismo va en aumento con reportes de resistencia a Ceftriaxona en Europa y Asia Pacífico. Prioridad 3: MEDIA – Streptococcus pneumoniae con susceptibilidad disminuida a la penicilina: Asociado a infecciones como otitis media aguda, sinusitis, neumonía y meningitis adquirida en la comunidad.

En Colombia se han reportado casos de resistencia a penicilinas, cefalosporinas y carbapenemicos en pacientes pediátricos de la Costa Caribe. – Haemophilus influenzae resistente a la ampicilina: Se relaciona con infecciones adquiridas en comunidad como otitis media aguda, sinusitis, meningitis y neumonías.

¿Qué se debe hacer para evitar la resistencia bacteriana?

Prevención de la resistencia bacteriana a antimicrobianos. Aspectos farmacológicos. Prevention of bacterial resistance to antimicrobial agents. Pharmacological aspects. Martín G, Carmona O. RESUMEN Con la aparición de los antimicrobianos, hace más de 60 años, cambió el curso de la historia de las enfermedades infecciosas; es así como la tasa de mortalidad disminuyó de 797 por cada 100.000 habitantes en 1900 a 36 por cada 100.000 habitantes para 1980.

Sin embargo, a pesar de los éxitos alcanzados por las medidas sanitarias preventivas y por el uso de fármacos antimicrobianos, siempre hubo preocupación, debido a que la introducción de un nuevo fármaco antimicrobiano iba seguida de resistencia bacteriana (RB) al mismo. De esta forma se plantean estrategias para la prevención de la RB, tanto en el ecosistema hospitalario como en el comunitario.

Algunas de las estrategias que deben ser tomadas en consideración en la comunidad son: control sobre el libre expendio de antimicrobianos, políticas sanitarias gubernamentales relacionadas con las medidas higiénicas, control de epidemias, vacunaciones y control del uso de antimicrobianos en veterinaria, entre otros.

En cuanto a las estrategias para el control de la RB en el medio hospitalario se hace énfasis en las medidas de asepsia y antisepsia que deben practicarse a diario en los hospitales por el equipo de salud. Además, se mencionan seis puntos importantes a tener en consideración en ambos ecosistemas. Por último, se dan recomendaciones, de manera de poner en práctica algunos conceptos farmacológicos: 1) En lo posible usar antimicrobianos de espectro reducido; 2) Usar combinaciones de antimicrobianos sólo cuando se justifique; 3) Usar antimicrobianos bactericidas; 4) Evitar la selección de terapia antimicrobiana empírica; 5) Restringir el uso profiláctico de los antimicrobianos; 6) Conocer y evaluar el concepto PK/PD en sus diferentes expresiones, de manera de asegurar el uso de dosis y tiempos adecuados, que repercutirá con mayor probabilidad de cura del paciente y menor posibilidad de aparición de resistencia; 7) Estar actualizado en los avances quimioterapéuticos.

Conclusiones: Las herramientas más importantes con las que contamos para controlar la RB son: la prevención de las infecciones y el uso adecuado de antimicrobianos. Sólo a través de una comisión de control de infecciones nosocomiales se podrá prevenir y controlar el problema, particularmente el relacionado con la RB a los antimicrobianos, el cual es considerado un “problema de Salud Pública” en todo el mundo.

Palabras-clave: Resistencia bacteriana, prevención, antimicrobianos, Infección nosocomial, control de infección, PK/PD, estrategias farmacológicas, estrategias de prevención, vigilancia de resistencia bacteriana a antimicrobianos. INTRODUCCIÓN Con la aparición de los antimicrobianos, hace más de sesenta años, cambió el curso de la historia de las enfermedades infecciosas; es así como la tasa de mortalidad disminuyó, de 797 por 100.000 en 1900 a 36 por 100.000 en 1980.1 Luego, en la década de los 80, hubo un aumento, debido fundamentalmente a la aparición del SIDA.

Si bien es cierto que el desarrollo y uso de los antimicrobianos ha sido una de las medidas más importantes que condujeron al control de las infecciones bacterianas en el siglo XX, otros avances médicos, como las vacunas y los programas de prevención efectivos, las mejoras en medidas sanitarias como la higiene, nutrición y niveles de calidad de vida, también contribuyeron a disminuir las enfermedades infecciosas.

1. Por otra parte, la terapia antimicrobiana le dio herramientas al médico para prevenir algunas infecciones y curar otras, además de interrumpir la transmisión de algunas de ellas.
2. Sin embargo, a pesar de los éxitos alcanzados por las medidas sanitarias preventivas y por el uso de estos fármacos, siempre hubo preocupación, pues la introducción de un antimicrobiano iba seguida de resistencia bacteriana (RB).

Es así como el primer caso de resistencia a antimicrobianos comenzó con la aparición de cepas de Staphylococcus resistentes a penicilina, a comienzos de los años 50. Posteriormente, la aparición de multirresistencia de Mycobacterium tuberculosis, Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Enterococcus, Shigella y Plasmodium falciparum se hizo presente.

Por otra parte, la resistencia de gérmenes nosocomiales a los antimicrobianos representa un grave problema, especialmente la relacionada con bacilos Gram-negativos como: enterobacterias ( K. pneumoniae, E. aerogenes, E. coli), P. aeruginosa, Acinetobacter sp, Serratia marcescens y cocos Gram-positivos como Staphylococcus resistentes a meticilina, Enterococcus resistentes a vancomicina y Streptococcus pneumoniae resistentes a penicilina.

Estrategias para la prevención de la RB. Como se ha discutido anteriormente, 2 el ecosistema hospitalario y el comunitario son diferentes y, como consecuencia, también las infecciones, su severidad, los gérmenes involucrados y la frecuencia de RB son diferentes, por lo que debemos plantearnos estrategias diferentes a la hora de hablar de prevención de la resistencia a los antimicrobianos.

• En la comunidad son fundamentales las políticas sanitarias gubernamentales relacionadas con la higiene, el control de epidemias y su erradicación, para evitar su transformación en infecciones endémicas, vacunaciones, medidas relacionadas con el mejoramiento de la calidad de vida, entre otras.
• Existen factores de riesgo global que contribuyen con el aumento de la resistencia bacteriana a los antimicrobianos en la comunidad, tales como el aumento del comercio internacional de alimentos, especialmente carnes, y el aumento de viajeros internacionales.

El control, en parte, se logra con el uso adecuado de antimicrobianos en animales (en veterinaria se usa antibióticos en cantidades exorbitantes).3 También es necesario en nuestro medio el “control sobre el expendio libre de antimicrobianos en las farmacias”.

En las farmacias no sólo existe el libre expendio de estos fármacos, sino que también en ellas se hacen “diagnósticos” y se “indican” inadecuadamente estos fármacos. La medida arriba mencionada será parte fundamental de la prevención de la RB a los antimicrobianos en la comunidad. Mientras que en la comunidad el número de pacientes involucrados es mayor, en el medio hospitalario la severidad del proceso infeccioso y la RB a los antimicrobianos son los mayores problemas a que se enfrenta día a día el grupo de salud del hospital.

Se han dado cifras de la mortalidad debida a la RB a los antimicrobianos en hospitales de países desarrollados; 4 también las diferencias de RB ante los diferentes antimicrobianos usados, en infecciones comunitarias y en infecciones hospitalarias (públicas y privadas) en Venezuela, las cuales ilustran el problema antes mencionado.5 Es importante señalar que en este medio un solo paciente puede, en pocas horas, influir en la ecología hospitalaria, si no se toman las medidas adecuadas de asepsia y antisepsia.

Las medidas de aislamiento del paciente, control del tráfico del personal en la UCI, adecuado uso de guantes, tapabocas y batas, 6 la presencia de lavamanos en las diferentes áreas críticas del hospital (UCI, cirugía, salas de hospitalización) y el uso de soluciones antisépticas, 7 son medidas sencillas, que no se cumplen en nuestro medio hospitalario.

Como hemos discutido anteriormente, 5 los hospitales con más de 500 camas (hospitales universitarios) son más susceptibles de sufrir estos problemas, debido a la presencia de mayor número de personas (incluyendo estudiantes, personal no entrenado y visitantes), y al esparcimiento de infecciones por gérmenes resistentes entre pacientes.

En relación con este último punto, hemos ilustrado estas diferencias en la frecuencia de resistencia entre hospitales públicos (universitarios) y hospitales privados.5 Además, en los hospitales se ha visto aumentada la población de alto riesgo, hospitalización prolongada de pacientes crónicos, especialmente en caso de inmunosuprimidos, y el aumento (frecuencia y tiempo) en el uso de procedimientos invasivos.

De esta manera, surgen los pacientes colonizados o infectados que “generan resistencias”, 8 localizados en UCI especialmente aquellos pacientes con sondas, infusiones intravenosas, respiradores y otros elementos. Estos pacientes deben recibir cuidados especiales en el tratamiento farmacológico y en las medidas de asepsia y antisepsia.

Tenemos evidencias que reflejan requerimientos especiales por parte de estos pacientes, pues hemos comprobado la diferencia en la frecuencia de RB entre los pacientes de salas quirúrgicas y las UCI.9 Además de las medidas especiales de asepsia y antisepsia para evitar la transmisión horizontal de gérmenes, y que también constituyen medidas de control de la infección en el medio hospitalario, existen otras medidas que pueden considerarse estrategias comunes, a saber: 1) Monitoreo del uso de antimicrobianos.

Sobre este punto hay mucho que hacer en nuestro país.2) Monitoreo de la RB a antimicrobianos. Este programa ha funcionado en nuestro país exitosamente por más de una década. Sus aportes han sido de gran relevancia.3) Minimizar el tiempo y optimizar el diagnóstico bacteriológico.

Para ello es necesario el uso de nuevas técnicas y metodologías. Es también imperativo el control de calidad en los laboratorios de bacteriología.4) Diagnostico clínico y microbiológico (presuntivos o definitivos) antes de instaurar la terapia antimicrobiana 5) Educación continua sobre el uso adecuado de antimicrobianos.6) Elaborar guías en cada hospital 10 basadas en los resultados del monitoreo de la RB y del uso local de antimicrobianos.

Medidas farmacológicas de prevención de la RB. Los antimicrobianos son los fármacos que ocupan el segundo lugar en frecuencia de indicaciones y su consumo alcanza toneladas por año.3 Debemos estar conscientes de que la terapia antimicrobiana es diferente a otras formas de farmacoterapia, pues en este caso, además de las características del paciente y el fármaco, existe la tercera variable, representada por el microorganismo responsable de la infección.

Por una parte, constituye una ventaja el hecho de que podemos estudiar parámetros farmacodinámicos con el microorganismo aislado del paciente (receptor); pero, por otra parte, se establece una compleja interrelación entre paciente, microorganismo y fármaco antimicrobiano. Así, la actividad del antimicrobiano trata de ser bloqueada por el mecanismo de resistencia creado por el microorganismo.

El uso del antimicrobiano es determinante en el desarrollo de RB ante él, y crea la presión de selección de cepas mutantes. Una serie de factores pueden influenciar la velocidad y tipo de mutantes que pueden ser seleccionados; así, la concentración de un antimicrobiano durante la selección va a determinar la frecuencia de aparición de mutantes resistentes.11 Por tanto, la concentración del antimicrobiano en el sitio de infección o en el plasma y su relación con la concentración inhibitoria mínima (CIM) es fundamental para prevenir la resistencia al antimicrobiano en el momento de instaurar la terapia farmacológica eficaz.

En relación con el parámetro farmacodinámico (CIM), su aumento, aunque sea pequeño, como consecuencia del uso del antimicrobiano, es manifestación de RB.11 Existen varios conceptos de gran importancia en el momento de indicar un antimicrobiano adecuadamente, 12 y de esta manera, controlamos o prevenimos la aparición de RB.

Para lograr estos fines se deben poner en práctica las siguientes recomendaciones.1) En lo posible usar antimicrobianos de espectro reducido, que sean eficaces contra el germen implicado. Evitar el uso de antimicrobianos de amplio espectro; éste cubriría más las deficiencias y temores de quien lo indica.

Así por ejemplo, si tenemos una infección por Streptococcus pyogenes que podría ser tratado con penicilina, entonces, ¿por qué indicar un novedoso antimicrobiano de amplio espectro y probablemente de menor eficacia? En Dinamarca 13 y Suecia, 14 países con la más baja incidencia de resistencia a antimicrobianos en el planeta, los fármacos más frecuentemente usados son los viejos y los de espectro reducido.

Además, usan los antimicrobianos sólo en aquellos casos con diagnóstico clínico y microbiológico. Por otra parte, se ha encontrado asociación entre el uso indiscriminado de antimicrobianos y el desarrollo de resistencia en los hospitales.15 2) Usar combinaciones de antimicrobianos, para aumentar la eficacia y disminuir la RB.

Esto se pone en práctica ante gérmenes con problemas de resistencia y en infecciones mixtas y severas. Existen estudios clínicos controlados en los cuales, usando el concepto PK/PD (/CIM), se demuestra que el uso de la terapia combinada produce menor frecuencia de resistencia que la monoterapia.16 3) Usar antimicrobianos bactericidas,

Esta recomendación es especialmente necesaria en los casos de inmunosuprimidos. No podemos dejar de mencionar el VIH, donde se hace necesario, no sólo el uso de varios antimicrobianos, sino también el uso de antimicrobianos bactericidas.4) Optimizar la selección y la duración de la terapia antimicrobiana empírica 5) Los tratamientos profilácticos sólo deben ser indicados cuando sea estrictamente necesarios y por el tiempo adecuado, de acuerdo a los gérmenes potencialmente involucrados.

• Generalmente este tipo de tratamiento es de corta duración.
• Esta es una de las indicaciones más frecuentemente incorrecta, tanto en los hospitales como en la comunidad.6) Conocer y evaluar las dosis y concentraciones de los antimicrobianos (parámetro farmacocinético) y su relación con la CIM (parámetro farmacodinámico).

Este concepto de PK/PD es actualmente considerado fundamental por el médico farmacólogo básico y clínico, para asegurar que la dosis seleccionada en relación con la CIM es la adecuada para garantizar la eficacia en los estudios de farmacología clínica de los antimicrobianos, desde sus primeras fases.17,18 En infecciones hospitalarias se hace actualmente necesario aplicar el concepto PK/PD, 16,19 ya no sólo para determinar eficacia, sino también asegurarse de que la concentración a ser alcanzada permita prevenir 20,21 la resistencia ( figura 1 ). Existen estudios in vitro 20,21 en modelos animales 20,22 y diversos ensayos clínicos realizados, 16,19,20 tanto en la Comunidad Europea como en EE UU, que demuestran una clara relación entre PK/PD (AUC 0-24 /CIM) y el desarrollo de resistencia bacteriana ante el antimicrobiano en estudio. Es importante enfatizar que la relación antes mencionada es más clara y evidente que cualquier otro factor de riesgo clínico en pacientes para predecir la aparición de RB. Se debe aclarar que el PK/PD y sus diferentes expresiones: AUC 0-24 /CIM, C max /CIM, T >/CIM ( figura 2 ) variará de acuerdo al germen involucrado, su CIM ante el antimicrobiano de elección y sus características farmacocinéticas. Por tanto, su uso debe ser individualizado, en lo posible, especialmente en aquellas infecciones por gérmenes nosocomiales 19 con alta posibilidad de resistencia. Una serie de factores pueden influenciar la velocidad y tipo de mutantes que pueden ser seleccionados bajo la presión de los antimicrobianos. La frecuencia de aparición de mutantes pueden variar en forma importante para un antimicrobiano, dependiendo de su concentración durante la selección. A bajas concentraciones de los antimicrobianos (referidas a la relación PK/PD) las mutaciones pueden proteger efectivamente a las bacterias de la acción de los antibióticos y ser seleccionadas. Sin embargo, una vez que la concentración del antibiótico aumenta, el número de bacterias mutantes seleccionables disminuye; estos resultados han sido puestos en evidencia en estudios a nivel molecular.11 Figura 2. PEAK/MIC, AUC24h/MIC y T>MIC son los principales índices de PK/PD relacionados con eficacia antimicrobiana. Las diferentes expresiones del PK/ PD (Cmax/MIC, AUC 24 / MIC, T encima de MIC) se han propuesto para evaluar y predecir la eficacia clínica de los antibióticos. Por ejemplo, fluoroquinolonas: AUC 24 / MIC; aminoglicósidos: Cmax/MIC; ß-lactámicos: T>MIC. Este método se propone como básico para optimizar la eficacia y minimizar las oportunidades de RB. Estas medidas deben ser tomadas directamente en el momento de administrar el adecuado tratamiento farmacológico al paciente.7) Considerar los nuevos avances quimioterapéuticos: a) nuevas moléculas de antimicrobianos con viejos mecanismos de acción, Los últimos en salir al mercado son fundamentalmente bacteriostáticos, inhibidores de síntesis proteica: 23 linezolid (oxazolidinona); sinercid (quinupristin/dalfopristin); éstos efectivos contra Gram-positivos. Telitromicina (ketólido), una molécula derivada de un macrólido, en la que un grupo cetona es sustituido por una cadena lateral, aumentando su actividad ante cepas resistentes. De esta forma, introduciendo cambios en las moléculas, es como se han actualizado algunas que alcanzaron alta capacidad de crear resistencia bacteriana; así surgieron: cefalosporinas de tercera y cuarta generación, carbapenemos y otros. b) nuevas moléculas con nuevos mecanismos de acción, Su introducción tomará algunos años, pues están en fases tempranas de investigación. Estos compuestos son: 1) inhibidores de mecanismo de resistencia: los inhibidores de las bombas de eflujo, 24 administrados conjuntamente con moléculas de antimicrobianos ya conocidas (quinolonas, ß-lactámicos, tetraciclinas, macrólidos), que activen estas bombas como mecanismo de resistencia en la bacteria.25 De este grupo inhibidor de bomba de eflujo, ya está en fases clínicas la glicilcilina23 (una tetraciclina con un inhibidor de la bomba de eflujo). Estos constituirían el segundo grupo de fármacos creados específicamente para inhibir resistencia; 25 el primer grupo conocido son los inhibidores de ß-lactamasa, los que aún están vigentes en su actividad; 26 2) Inhibidores de la secreción de proteinas; 27 3) Uso del NO (oxido nítrico ) exógeno como bactericida.28 Por otra parte, el conocimiento del genoma humano y bacteriano seguramente aportará nueva metodología y tecnología que contribuirá en el futuro, 29 tanto en el diagnóstico como en la prevención de la RB. CONCLUSIONES Las herramientas más importantes con las que contamos para controlar la RB son la prevención de las infecciones y el uso adecuado de los antimicrobianos. Creemos que se requieren estrategias más efectivas para controlar la selección y dispersión de microorganismos infecciosos y especialmente los resistentes. La prevención de la resistencia bacteriana pasa por la prevención de la enfermedad infecciosa. Cuando usamos un antibiótico para prevenir una enfermedad infecciosa es porque hemos fallado en prevenir la enfermedad. Los esfuerzos sanitarios tienen que ir dirigidos a prevenir la enfermedad, más que a tratarla; esta es la medicina del futuro. El mejor mecanismo para prevenir la resistencia a los antimicrobianos incluye: las vacunas, interrupción de la transmisión horizontal de los microorganismos mediante medidas higiénicas y sanitarias y, en el hospital, la aplicación de las normas de control de las infecciones nosocomiales. Sólo a través de una comisión de control de infecciones nosocomiales, integrada por personas expertas y motivadas, se podrá prevenir y controlar este problema; particularmente el relacionado directamente con la resistencia bacteriana a los antimicrobianos, el cual es considerado actualmente un “problema de Salud Pública”2 en todos los países del mundo. BIBLIOGRAFÍA: 1. Armstrong GL, Conn LA, Pinner RW. 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¿Qué pasa si comes carne con antibióticos?

Un problema de capitalismo que afecta a nuestra salud – El problema del abuso de antibióticos en ganadería y la creación de superbacterias es más una cuestión de capitalismo que de sanidad: los fármacos veterinarios, muchos de ellos muy similares a los empleados en seres humanos, se fabrican en el tercer mundo con costes muy bajos y están destinados a un uso extensivo.

• Es decir que se mezclan con el pienso, muchas veces en el mismo suelo de la granja.
• Su objetivo es provocar un crecimiento más rápido en el animal al impedir que desarrolle enfermedades bacterianas, de modo que cumpla su ciclo hasta el matadero más rápido, y así poder encajar antes una nueva camada.
• Así se acortan los periodos de cría, se ahorra y se incrementan los márgenes de beneficio.

Every year, two million Americans contract antibiotic-resistant infections, and 23,000 die from them — As You Sow (@AsYouSow) De este modo, el animal los ingiere o no. Si los ingiere, los antibióticos entraran en su organismo y se procesarán, pudiendo acumularse en las vísceras, la carne y la sangre, pero poco a poco serán excretados al medio, la mayor parte de las veces sin metabolizar.

1. De ahí pueden ir al subsuelo con los lavados o la lluvia y pasar a ríos, lagos o canales de consumo humano de agua.
2. Si el animal no los ingiere y quedan en el suelo, o no son debidamente reciclados, pasarán también al subsuelo y de ahí a las aguas subterráneas.
3. El gran problema de estas sustancias es que su presencia masiva en el medio provoca los efectos contrarios a los que están destinados: hacen que las bacterias mutantes capaces de resistirlos se impongan y prosperen, creando focos de superbacterias.

Si luego una superbacteria ataca a una persona, es posible que está no tenga forma de curarse con antibióticos y acabe incluso muriendo de lo que de otro modo sería una simple infección.

¿Cómo se determina si dichas bacterias son sensibles o resistentes a los antibióticos utilizados?

Resumen Los métodos más frecuentemente utilizados en Microbiología Clínica para la determinación de la sensibilidad de las bacterias a los antibióticos se basan en un estudio fenotípico, observando el crecimiento bacteriano de una cepa incubada en presencia del antibiótico a estudiar.

1. Estos métodos requieren normalmente un tiempo de unas 24 h para la obtención de resultados.
2. En esta revisión se exponen el fundamento y los resultados de las principales técnicas instrumentales que proporcionan un antibiograma rápido.
3. De manera pormenorizada se exponen datos relativos a técnicas moleculares, microarrays, métodos comerciales utilizados en el trabajo de rutina, técnicas inmunocromatográficas, métodos colorimétricos, métodos de imagen, nefelometría, espectrometría de masas MALDI-TOF, citometría de flujo, quimioluminiscencia y bioluminiscencia, microfluidos y métodos de lisis bacteriana.

Palabras clave: Antibiograma rápido Antibiograma directo Sensibilidad Abstract The most widely used antibiotic susceptibility testing methods in Clinical Microbiology are based on the phenotypic detection of antibiotic resistance by measuring bacterial growth in the presence of the antibiotic being tested.

1. These conventional methods take typically 24 hours to obtain results.
2. Here we review the main techniques for rapid determination of antibiotic susceptibility.
3. Data obtained with different methods such as molecular techniques, microarrays, commercial methods used in work routine, immunochromatographic methods, colorimetric methods, image methods, nephelometry, MALDI-TOF mass spectrometry, flow cytometry, chemiluminescence and bioluminescence, microfluids and methods based on cell disruption are analysed in detail.

Keywords: Rapid antibiotic susceptibility test Direct antibiotic susceptibility test Susceptibility Texto completo Introducción Para conseguir una evolución clínica favorable de los pacientes que padecen infecciones, el laboratorio de Microbiología Clínica debe informar lo más rápidamente posible el agente causal de dicha infección.

1. Si es una bacteria que no presenta una sensibilidad homogénea a los antibióticos se debe informar, además, el antibiograma, ya que el notable aumento de resistencias a antimicrobianos dificulta, en algunos casos, el tratamiento empírico.
2. Las técnicas rutinarias del antibiograma se basan en un estudio fenotípico en el que se observa el crecimiento microbiano en presencia de diferentes antibióticos.

Estas técnicas incluyen la dilución en agar ( gold standard del antibiograma), macrodilución y microdilución en caldo, tiras con un gradiente de antibiótico, y requieren unas 17 h para la obtención de resultados. Con el fin de acortar este tiempo, sería deseable disponer de los resultados del antibiograma de una forma rápida y fiable.

Para evaluar la fiabilidad, de acuerdo con la Food and Drug Administration (FDA) 1, los resultados de un antibiograma rápido se clasifican, con respecto al antibiograma obtenido mediante el gold standard, como agreements (concordancia), minor errors (resultado erróneo de una sensibilidad intermedia), major errors (falsa resistencia) y very major errors (falsa sensibilidad).

Existe un considerable número de técnicas instrumentales que permiten llevar a cabo un antibiograma rápido. Entre estas cabe destacar las técnicas moleculares, microarrays, métodos comerciales utilizados en el trabajo de rutina, técnicas inmunocromatográficas, métodos colorimétricos, métodos de imagen, nefelometría, espectrometría de masas MALDI-TOF, citometría de flujo, quimioluminiscencia y bioluminiscencia, microfluidos y métodos de lisis bacteriana.

• A continuación se expone el fundamento de cada una de estas técnicas y los resultados obtenidos.
• Técnicas moleculares Las técnicas moleculares permiten la detección de material genético, tanto ácido desoxirribonucleico (ADN) como ácido ribonucleico (ARN).
• Entre las técnicas moleculares, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es la que ha adquirido un mayor valor diagnóstico, ya que permite una identificación certera del agente infeccioso, además de ser el método de referencia para caracterizar sus genotipos de resistencia y virulencia.

La realización de una PCR convencional requiere aproximadamente unas 12 h y consta de 3 etapas. La primera consiste en una extracción del material genético. La segunda etapa, llevada a cabo en un termociclador, se corresponde con la amplificación del ADN.

El termociclador permite alcanzar las temperaturas óptimas necesarias para que tengan lugar cada uno de los 3 pasos de los que consta un ciclo de amplificación (desnaturalización del ADN que se va a usar como molde, anillamiento de cebadores sintéticos o primers y extensión catalizada por la ADN polimerasa de los primers ).

La amplificación se repite un número determinado de veces, generalmente de 25 a 35, duplicándose cada vez el número de moléculas de producto (amplicones). De esta forma se sintetiza un elevado de amplicones, lo que permite detectar cantidades iniciales de ADN muy pequeñas 2,

Finalmente, en la tercera etapa de la PCR se lleva a cabo la detección de los amplicones mediante electroforesis en gel de agarosa. Con el fin de acortar el tiempo de diagnóstico de la PCR convencional se ha diseñado la PCR en tiempo real, en la que paralelamente a la amplificación tiene lugar, mediante diferentes métodos, la detección de los amplicones sintetizados.

De este modo, la PCR en tiempo real permite obtener resultados en pocas horas 2, Se han comercializado varias PCR en tiempo real que permiten obtener la identificación de varios agentes patógenos y de los genes que confieren resistencia a antibióticos directamente a partir de diferentes muestras.

• Estas PCR están totalmente automatizadas, de tal forma que el procesamiento de las muestras solo requiere unos minutos.
• El sistema Verigene ® (Nanosphere) se aplica a partir de frascos de hemocultivo crecidos.
• La detección de los amplicones tiene lugar mediante hibridación con oligonucleótidos específicos sintéticos marcados con nanopartículas de oro.

En bacterias grampositivas detecta, en menos de 3 h y con una sensibilidad y especificidad muy cercanas al 100%, 9 especies y 4 géneros bacterianos, así como los genes de resistencia mecA y vanA/B 3, En bacterias gramnegativas detecta, con el mismo tiempo de respuesta y con una sensibilidad y especificidad superiores al 93%, 5 especies y 4 géneros bacterianos, y los genes de resistencia que codifican β-lactamasas de espectro extendido (BLEE) tipo CTX-M y carbapenemasas tipo KPC, NDM, VIM, IMP y OXA 4,

• El sistema FilmArray Blood Culture Identification Panel (BioFire Diagnostics) también se aplica a partir del frasco de hemocultivo crecido.
• En este caso se realiza una PCR anidada en la que primero se amplifica una región de ADN que contiene el segmento diana.
• Después, este producto de amplificación se utiliza como molde de una segunda PCR que tiene lugar en una matriz con pocillos que contienen los primers de los diferentes ensayos.

Finalmente, mediante el fluorocromo LCGreen ® Plus (BioFire Diagnostics), el instrumento evalúa la curva de fusión del ADN en cada pocillo de la matriz para determinar si aparece, en dicho pocillo, un producto de la PCR. Este sistema detecta, en una hora, 11 especies y 15 géneros de bacterias grampositivas y gramnegativas, y 5 especies de levaduras.

Además detecta los genes de resistencia mecA, vanA/B y KPC, La sensibilidad oscila entre el 83 y el 100% y la especificidad es superior al 99%, dependiendo del patógeno estudiado 3, El sistema GeneXpert ® realiza la PCR en tiempo real en cartuchos desechables de un solo uso. Existe un número considerable de cartuchos para llevar a cabo diferentes análisis.

Para la detección de Staphylococcus aureus y su resistencia a meticilina a partir de muestras clínicas están disponibles 2 cartuchos, el Xpert MRSA/SA ® BC, que se utiliza a partir de frascos de hemocultivo crecidos, y el Xpert® MRSA/SA SSTI, que se utiliza a partir de hisopos para el diagnóstico de infecciones de piel y tejidos blandos.

1. Ambas pruebas requieren una hora para la obtención de resultados y presentan una sensibilidad y especificidad muy cercanas al 100% 3,5,
2. El cartucho Xpert MTB/RIF ® detecta Mycobacterium tuberculosis y su resistencia a rifampicina a partir del esputo y de líquidos biológicos en 2 h.
3. En este caso tiene lugar una PCR anidada semicuantitativa.

Se ha observado que en el esputo y en el lavado broncoalveolar la prueba presenta una sensibilidad y una especificidad del 86,8 y del 93,1%, respectivamente, mejorando los resultados de la baciloscopia 6, En la literatura se han descrito un considerable número de PCR, tanto «caseras» como comerciales y automatizadas, y kits para PCR que detectan, de forma certera y con una sensibilidad y especificidad prácticamente del 100%, un gran número de genes que confieren resistencia a los antibióticos 7,

Es preciso señalar que estas metodologías no proporcionan la identificación microbiana y que se aplican, en la mayoría de los casos, a partir de colonias crecidas en las placas de aislamiento. Entre de las PCR comerciales automatizadas en tiempo real cabe destacar las siguientes. La plataforma NucliSENS EasyQ ® KPC (bioMérieux) detecta, en 2 h, genes que codifican carbapenemasas tipo KPC 8,

El cartucho Xpert Carba-R ® de GeneXpert ® detecta, en una hora, genes que codifican carbapenemasas tipo KPC, NDM, VIM, IMP y OXA-48 9, El sistema eazyplex ® (Amplex Biosystems GmbH) consiste en una plataforma que realiza la amplificación de ácidos nucleicos mediante la técnica loop-mediated isothermal amplification (LAMP).

• Esta técnica se fundamenta en la amplificación de ADN por desplazamiento de cadena a una temperatura constante; de este modo, el sistema no precisa de termociclador.
• Para llevar a cabo la amplificación, el ADN extraído es introducido en un tubo que contiene un liofilizado con los reactivos necesarios para llevar a cabo la amplificación de ácidos nucleicos; seguidamente, este tubo es introducido en el equipo Genie ® II (OptiGene) que mantiene el tubo a una temperatura constante y detecta, en tiempo real, los amplicones formados.

Para esta plataforma se han comercializado varios kits que detectan, en menos de 30 min, genes que confieren resistencia a antibióticos. Uno a destacar es el eazyplex ® SuperBug CRE que detecta, tanto a partir de colonias crecidas en las placas de aislamiento como directamente a partir de muestras de orina y frascos de hemocultivo crecidos, genes que codifican BLEE tipo CTX-M y carbapenemasas tipo VIM, NDM, KPC y OXA-48 10,

1. AID Autoimmun Diagnostika GmbH ha comercializado una PCR basada en ensayos de sondas en línea.
2. En este caso, una vez que se ha realizado la PCR tiene lugar la hibridación reversa de los amplicones con sondas complementarias ancladas a una tira de nitrocelulosa.
3. La hibridación es detectada utilizando un marcador de biotina presente en los primers utilizados en la PCR, obteniéndose un patrón de bandas que se interpreta de forma visual o con un escáner.

Entre los kits de resistencia a antibióticos destaca el AID ESBL que detecta genes que codifican BLEE tipo TEM, SHV y CTX-M y carbapenemasas tipo KPC en 5 h 11, Entre los kits comercializados para la detección de genes que confieren resistencia bacteriana a los antibióticos es interesante destacar los siguientes: LightMix (Roche Diagnostics) y Check-Direct CPE (Check-Points Health B.V.).

El LightMix, utilizando la plataforma LightCycler ® 480 Instrument II (Roche Diagnostics), detecta carbapenemasas tipo KPC, NDM, VIM, IMP y OXA-48 en una hora y media. Cabe resaltar que este kit también puede ser aplicado a partir de frascos de hemocultivo crecidos 12, El kit Check-Direct CPE puede utilizarse en varias plataformas de PCR en tiempo real, como la ABI 7500 (Applied), CFX96™ (Bio-Rad), LightCycler ® 480 system I & II (Roche), Rotor-Gene Q (Qiagen) y BD MAX™ (Becton Dickinson).

Este kit incorpora los reactivos necesarios para la detección, en 2 h, de genes que codifican carbapenemasas tipo KPC, NDM, VIM y OXA-48 9, Asimismo, se han comercializado algunos kits para la realización de una PCR mediada por ligación. Resumidamente, en esta PCR se utilizan 2 sondas de ADN que reconocen una de las 2 hebras del gen que interesa detectar.

1. En caso de producirse la hibridación, las sondas quedan adyacentes y una ADN ligasa se encarga de unirlas, generando un ADN de doble cadena.
2. Este paso de ligación se realiza en el equipo MyCycler (Bio-Rad).
3. Por último, la PCR en tiempo real tiene lugar en la plataforma ABI 7500 (Applied) utilizando unos primers universales.

Entre los kits que detectan genes que codifican resistencias bacterianas a antibióticos mediante PCR por ligación cabe resaltar dos: uno para BLEE tipo CTX-M, TEM y SHV 13 y otro para carbapenemasas tipo KPC, NDM, IMP, VIM, y OXA-48 14, Ambos kits proporcionan resultados en 4 h y media.

1. Por último, cabe destacar que los métodos moleculares comerciales mencionados anteriormente presentan un escaso porcentaje de falsos negativos debido a que estos métodos no detectan todas las variantes alélicas de los genes que confieren resistencia a los antibióticos 15,
2. Microarrays Esta metodología se basa en la detección, mediante un análisis de imágenes, de la hibridación de una molécula diana a una sonda específica inmovilizada en un soporte sólido.

Los microarrays detectan un gran número de genes de resistencia en un mismo ensayo dado que estas sondas, que normalmente son oligonucleótidos, están pegadas a una distancia muy corta. Se han comercializado varios microarrays, como el Check-MDR CT102, el Check-MD CT103 y el Check-MDR CT103 XL (Check points Health BV), que permiten detectar un gran número de genes que codifican diferentes β-lactamasas (BLEE, AmpC y carbapenemasas) a partir de colonias crecidas en placas de aislamiento.

Estos 3 microarrays precisan de un primer paso de una PCR con una pareja de primers o cebadores universales marcados con biotina. A continuación, los amplicones son clasificados mediante hibridación con las sondas de oligonucleótidos. Finalmente, el software del fabricante detecta la hibridación utilizando el marcador de biotina y traduce los datos automáticamente, expresando los resultados en forma de presencia o ausencia de un gen.

Estos microarrays precisan 8 h para la obtención de los resultados y presentan una sensibilidad y una especificidad prácticamente del 100% 16-18, Métodos comerciales de antibiograma Diferentes métodos comerciales de antibiograma utilizados en la rutina de trabajo del laboratorio de Microbiología Clínica se han aplicado directamente a partir de diferentes muestras clínicas.

Las tiras comerciales con un gradiente de antibiótico se han utilizado para realizar un antibiograma directo a partir de muestras respiratorias. Para ello, la muestra se siembra en masiva en placas de agar Mueller Hinton y seguidamente se depositan las tiras con antibiótico. Las placas son incubadas durante 24 h y, una vez crecidas las colonias, se obtiene la CMI.

Boyer et al.19 obtuvieron un 88,9% de agreements, un 1,5% de very major errors y un 9,6% de major errors, y Bouza et al.20 un 96,44% de agreements, un 1,98% de major errors y un 1,56% de minor errors. Los métodos de microdilución en caldo semiautomatizados (MicroScan, VITEK2 y Phoenix) permiten obtener la identificación bacteriana y el antibiograma directamente a partir del frasco de hemocultivo crecido.

• Para la identificación bacteriana se requieren 3 h, con pobres resultados en bacterias grampositivas y aceptables en gramnegativas; para obtener el antibiograma se precisan 14 h, obteniendo buenos resultados en bacterias tanto grampositivas como gramnegativas 2,
• Técnicas inmunocromatográficas Estas técnicas requieren unos 20 min para la obtención de resultados.

Tienen un precio económico y no precisan ni de instrumentación ni de personal experto, por lo que pueden ser realizadas en cualquier laboratorio. En el caso de resistencias a antibióticos permiten detectar enzimas bacterianas que hidrolizan el antibiótico.

El procedimiento consiste en suspender la bacteria en un diluyente. A continuación, unas gotas de este se depositan en un extremo de la tira (normalmente de nitrocelulosa) y las bacterias se desplazan por capilaridad hacia el otro extremo de la tira. Si en la posición test de la tira, donde está fijado un anticuerpo que reconoce el antígeno de la bacteria, aparece una banda coloreada significa que la prueba es positiva.

Se han comercializado 2 inmunocromatografías que detectan carbapenemasas tipo OXA-48 y KPC (Coris BioConcept) con una sensibilidad y una especificidad prácticamente del 100% 21, Para la detección de la resistencia de S. aureus a meticilina se ha comercializado el test BinaxNOW PBP2a (Alere).

Este test muestra una sensibilidad y uan especificidad prácticamente del 100%; además, también se aplicó a partir de frascos de hemocultivo crecidos, ofreciendo una sensibilidad del 95,4% y una especificidad prácticamente del 100% 3, Métodos colorimétricos Para la detección de carbapenemasas se han comercializado varios kits, como el RAPIDEC ® CARBA NP (bioMérieux) y Rapid CARB Screen ® (Rosco Diagnostica A/S), que proporcionan resultados en unas 2 h con sensibilidad y especificidad muy próximas al 100% 22,

En estos test, la bacteria se incuba en presencia del antibiótico. Si la bacteria posee una carbapenemasa, el antibiótico se hidroliza y se produce un cambio en el pH del medio que se detecta mediante un cambio de color del indicador. Estos test no caracterizan el tipo de carbapenemasa.

1. Sin embargo, al realizar un estudio fenotípico, pueden detectar cualquier variante de carbapenemasa que se esté expresando.
2. La resazurina, añadida a una suspensión bacteriana resistente al antibiótico con el que es incubada, es reducida por la actividad metabólica de la bacteria.
3. Si la bacteria es sensible al antibiótico se detiene su metabolismo, con lo que la resazurina permanece en su forma oxidada.

Dado que la forma reducida de resazurina es estable y de color rojo, y fotométricamente distinguible de la forma oxidada, que es de color azul, la viabilidad celular puede ser monitorizada mediante espectrofotometría, colorimetría o fluorimetría. Coban et al.23,24 determinaron en 6 h la sensibilidad de S.

aureus a meticilina y vancomicina. March et al.25,26 realizaron un antibiograma en 2 h para estafilococos, enterococos y enterobacterias. Sin embargo, el inconveniente de la resazurina es que no es metabolizada por los bacilos gramnegativos no fermentadores. Otro método colorimétrico consiste en la medición de la actividad de la enzima bacteriana nitrato reductasa.

Cuando la bacteria es incubada en presencia de iones NO 3 − y antibiótico, si la bacteria es resistente al antibiótico se van a generar iones NO 2 − que, con los reactivos de Gries, originan un compuesto de color rojo. Con este método se ha determinado en unas 6 h la sensibilidad de S.

1. Aureus a meticilina y vancomicina 23,24,
2. Estos 2 métodos colorimétricos también han sido aplicados en micobacterias, obteniendo el antibiograma en un tiempo de 7 a 14 días 27,
3. En todos los casos la correlación obtenida con los métodos de referencia ha sido cercana al 100%.
4. Métodos de imagen A partir de frascos de hemocultivo crecidos el equipo ACCELERATE pheno™ SYSTEM (Accelerate Diagnostics) proporciona, en una hora, la identificación de 10 especies y 6 géneros bacterianos mediante la técnica de hibridación in situ fluorescente (FISH).

Para llevar a cabo el antibiograma directo se monitoriza, mediante la toma de imágenes, el crecimiento bacteriano de una cepa incubada en presencia de diferentes concentraciones de antibiótico. De este modo, este equipo informa, en 5 h, la CMI y los fenotipos de resistencia de alto nivel a gentamicina y estreptomicina en enterococos y de inducción de resistencia a clindamicina por eritromicina en estafilococos.

Dependiendo del patógeno estudiado, la sensibilidad obtenida concuerda entre un 92% y un 100% con la obtenida mediante microdilución en caldo 28, Nefelometría La nefelometría es una técnica que mide la intensidad de radiación dispersa que se genera cuando un haz de luz atraviesa una suspensión de partículas.

Dado que la dispersión de luz es proporcional a la concentración de partículas, esta técnica instrumental permite la cuantificación de microorganismos 2, El equipo Alfred 60 (Alifax) lleva a cabo un cribado de muestras de orina para el diagnóstico de infecciones del tracto urinario.

Para ello, una alícuota de orina es inoculada en un tubo con medio líquido de enriquecimiento y el crecimiento bacteriano es monitorizado durante 3 h mediante nefelometría. Con este equipo, monitorizando el crecimiento bacteriano en tubos comercializados que contenían medio líquido de enriquecimiento y antibiótico junto con una alícuota de la muestra, se ha realizado un antibiograma en 5 h directamente a partir de orinas y frascos de hemocultivo 29,30,

Espectrometría de masas MALDI-TOF El sistema MALDI-TOF proporciona, mediante un análisis de proteínas, la identificación de bacterias (incluyendo micobacterias), levaduras y hongos filamentosos en minutos 2, En cuanto al antibiograma rápido, el sistema MALDI-TOF predice en menos de 3 h si las bacterias producen enzimas que hidrolizan los antibióticos, como por ejemplo carbapenemasas y BLEE.

Para ello, los microorganismos son incubados durante un tiempo con el antibiótico. Se realiza una centrifugación y el sobrenadante obtenido se analiza mediante MALDI-TOF. Si el microorganismo posee la enzima que degrada el antibiótico se observará la desaparición del pico correspondiente al antibiótico y la aparición de nuevos picos que corresponden a los metabolitos resultantes de la rotura del antibiótico.

En caso de que la bacteria no hidrolice el antibiótico únicamente se observará el pico correspondiente al antibiótico. Esta metodología ha proporcionado sensibilidades prácticamente del 100%, tanto a partir de colonias crecidas en las placas de aislamiento 31, como a partir de frascos de hemocultivo crecidos de pacientes 32,

También es posible predecir la resistencia a cloranfenicol y clindamicina mediante la detección de la metilación del ARNr 16S llevada a cabo por metiltransferasas 33, Por otra parte, se ha observado que tanto las cepas de S. aureus sensibles a meticilina como las resistentes proporcionan unos picos de identificación específicos; de esta forma, a partir de una base de datos, normalmente elaborada en el propio laboratorio, es posible diferenciar, en unos minutos, entre cepas de S.

aureus resistentes y sensibles a meticilina a partir de colonias crecidas en las placas de aislamiento 34, De la misma manera, el sistema MALDI-TOF también discrimina entre cepas de enterococo sensibles y resistentes a vancomicina 35, También es posible estudiar la sensibilidad a los antibióticos mediante la incubación de microorganismos en presencia de antibiótico en un medio con moléculas marcadas con isótopos.

Si el microorganismo es resistente, este incorporará las moléculas marcadas que podrán ser detectadas mediante MALDI-TOF 36, Jung et al.37 desarrollaron un antibiograma basado en un análisis semicuantitativo. Incubaron en un medio líquido una alícuota del frasco de hemocultivo crecido, tanto en presencia como en ausencia de antibiótico, siendo esta última el grupo control.

A partir de los sedimentos obtuvieron los espectros de masas y calcularon la intensidad relativa de los picos y el área bajo la curva (AUC). Para la interpretación del antibiograma, consideraron que una cepa era resistente al antibiótico si esta, al ser incubada con el antibiótico, proporcionaba una intensidad de picos y AUC similares a los del grupo control.

• Por contra, consideraron que una cepa era sensible al antibiótico si esta, al ser incubada con antibiótico, proporcionaba una intensidad de picos y AUC menores que los del grupo control.
• De este modo obtuvieron un antibiograma a partir del frasco de hemocultivo crecido en 4 h con un 2% de discrepancias con respecto a la sensibilidad obtenida mediante E-test.

Citometría de flujo La citometría de flujo es una técnica basada en la formación de un flujo de partículas (generalmente células) ordenadas en fila con una intensidad de 500-4.000 partículas/segundo. Gracias a este alineamiento, la técnica permite medir simultáneamente múltiples características de una sola célula de tal forma que es posible caracterizar, separar y cuantificar las diferentes subpoblaciones celulares que se engloban en un conjunto.

Además, utilizando diversos fluorocromos se pueden estudiar diversos parámetros bacterianos (potencial de membrana, tamaño celular, actividad enzimática, integridad de la membrana celular y concentración microbiana) que aportan información acerca de la sensibilidad de los microorganismos a los antibióticos 2,

Shrestha et al.38 lograron diferenciar, mediante histogramas en los que se representó la luz dispersa en un ángulo de 90 grados (SSC) frente a la señal de fluorescencia, entre cepas de S. aureus resistentes y sensibles a meticilina tras una incubación de 4 h en presencia del antibiótico.

1. El citómetro de flujo Sysmex UF-1000i (Sysmex Corporation) es un equipo empleado en los laboratorios de Microbiología para llevar a cabo un cribado de orinas mediante el recuento de bacterias.
2. Este equipo ha sido utilizado para obtener 2 antibiogramas mediante la comparación de los recuentos obtenidos a partir de cepas incubadas en medio líquido con antibióticos con los recuentos de las mismas cepas incubadas sin antibiótico (grupo control).

Se consideró que una cepa era resistente al antibiótico si esta, al ser incubada con el antibiótico, proporcionaba un recuento microbiano muy similar al del grupo control. Por el contrario, se consideró que una cepa era sensible al antibiótico si esta, al ser incubada con el antibiótico, proporcionaba un recuento microbiano menor que el del grupo control.

1. Broeren et al.39 calcularon la CMI de amoxicilina, gentamicina y piperacilina en Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa y S. aureus,
2. En 4 h obtuvieron un antibiograma que se correlacionó en un 100% con el obtenido mediante los sistemas VITEK2, E-test y macrodilución en caldo.
3. March et al.40 realizaron un antibiograma a partir de 100 frascos de hemocultivo crecidos y obtuvieron, en tan solo 2 h, una concordancia del 98% con respecto a la sensibilidad obtenida mediante los métodos comerciales E-test, MicroScan y VITEK2.

Por otra parte, Faria-Ramos et al.41, a partir de bacterias incubadas en presencia de ceftazidima y cefotaxima con y sin ácido clavulánico, y utilizando el fluorocromo DiBAC 4 (3), que solo penetra en las bacterias inviables, lograron discriminar, en menos de 3 h, entre cepas productoras y no productoras de BLEE.

• Gauthier et al.42 realizaron un antibiograma mediante citometría de flujo a partir de orina.
• Usaron 2 fluorocromos, el DiBAC 4 (3) y el yoduro de propidio, que también penetra únicamente en bacterias no viables.
• Analizaron 114 muestras de orina y, realizando mediciones de la señal fluorescente tras una incubación de 2 h de las alícuotas de orina en presencia de diferentes antibióticos, obtuvieron un 2% de discrepancias con respecto a la sensibilidad obtenida mediante microdilución en caldo.

En levaduras, mediante el uso de yoduro de propidio, es posible obtener un antifungigrama en 6 h 43,44, En micobacterias, Pina-Vaz et al.45 determinaron la sensibilidad de M. tuberculosis a estreptomicina, isoniazida, rifampicina y etambutol. Después de 3 días de incubación en presencia del antituberculoso en el sistema BACTEC MGIT 960 (Becton Dickinson), los microorganismos se tiñeron con el fluorocromo SYTO 16, que solo penetra en los microorganismos con alteración de la membrana celular.

Comparando la intensidad de la señal de fluorescencia obtenida a partir de estos microorganismos con la obtenida a partir microorganismos incubados durante el mismo tiempo sin la presencia del antituberculoso, pudieron diferenciar entre cepas sensibles, intermedias o resistentes, obteniendo unos resultados que mostraron una excelente concordancia con los obtenidos mediante una incubación de unas 3 semanas en el sistema BACTEC MGIT 960.

Kirk et al.46 determinaron la sensibilidad de M. tuberculosis estudiando la capacidad de la micobacteria para hidrolizar, mediante esterasas, el sustrato diacetato de fluoresceína que pasa a fluoresceína, compuesto que emite fluorescencia cuando se excita con luz de una longitud de onda adecuada.

Si la micobacteria es sensible al antituberculoso, la capacidad hidrolítica de la micobacteria disminuye y, por lo tanto, la señal de fluorescencia detectada también disminuye. Comparando la señal de fluorescencia y la luz dispersa a 90 grados obtenidas mediante citometría de flujo a partir de micobacterias sin contacto con el antituberculoso con las señales obtenidas a partir de micobacterias con una incubación de 24 h con isonizida, etambutol y rifampicina obtuvieron concordancias del 95, del 92 y del 83%, respectivamente, con respecto al antibiograma obtenido mediante el método de las proporciones.

Quimioluminiscencia y bioluminiscencia La quimioluminiscencia es un proceso de emisión de luz que ocurre en ciertas reacciones químicas cuando las moléculas excitadas vuelven al estado fundamental. Para la obtención de luz solo se requiere la adición de menadiona al cultivo del microorganismo.

1. La membrana bacteriana es permeable a esta molécula.
2. Una vez la menadiona se encuentra en el interior de los microorganismos, esta es reducida y se generan diversos compuestos que difunden al medio extracelular donde, al autooxidarse, se emiten fotones de luz 2,
3. La viabilidad de los microorganismos se establece comparando la señal quimioluminiscente de cepas incubadas con antibióticos con la de las mismas cepas incubadas sin antibióticos 47-50,

Si la cepa es sensible al antibiótico, esta proporcionará, al ser incubada con antibiótico, una señal mucho menor que la del cultivo sin antibiótico; si es resistente, las señales obtenidas a partir de los cultivos incubados en presencia y ausencia de antibiótico serán muy similares.

La quimioluminiscencia proporciona, con una incubación de unas 4 h, CMI que concuerdan entre un 88% y un 100% con las CMI obtenidas mediante macrodilución o microdilución en caldo 47,48,50, También permite, en un tiempo de 8 h, detectar cepas de S. aureus intermedias y heterorresistentes a vancomicina 49,

Finalmente, en micobacterias se ha observado que es posible determinar la sensibilidad mediante quimioluminiscencia en 4 días 51, La bioluminiscencia es una forma de quimioluminiscencia que aparece como consecuencia de una reacción química que tiene lugar en algunos organismos vivos, como por ejemplo las luciérnagas 2,

Los trabajos realizados sobre antibiograma se fundamentan en la medida de los niveles de ATP bacteriano de origen intracelular, extracelular o total, comparando la señal bioluminiscente obtenida a partir de microorganismos incubados sin la presencia de antibiótico (grupo control) con la señal obtenida a partir de los mismos microorganismos incubados en presencia de antibiótico 52,53,

Con respecto al grupo control, si se mide el ATP intracelular, las cepas sensibles al antibiótico estudiado proporcionarán una disminución de la señal de bioluminiscencia 54 ; si se mide el ATP extracelular las cepas sensibles producirán un aumento de la señal 55, y si se mide el ATP total las cepas sensibles proporcionarán una disminución de la señal de ATP 52,53,56,

1. En cambio, si el microorganismo es resistente al antibiótico las medidas del grupo control serán prácticamente iguales que las obtenidas a partir de las cepas incubadas con antibiótico.
2. Con esta metodología es posible obtener un antibiograma fiable en tan solo 2 h 56,
3. Además, se han publicado varios trabajos que hacen referencia a antibiogramas obtenidos mediante bioluminiscencia a partir de muestra directa.

Ivancic et al.57 realizaron un antibiograma a partir de orina comparando la señal de ATP obtenida a partir de una alícuota de orina incubada sin antibiótico con la señal de ATP de otra alícuota de la misma orina incubada con antibiótico. De este modo, lograron, en 2 h, un 91% de concordancia con la CMI obtenida a partir de la colonia.

1. Dong y Zhao 58 desarrollaron un simulador de microfluidos con anticuerpos inmovilizados mediante el cual se obtiene, a partir de orina, la identificación de 13 especies bacterias y el antibiograma en 6 h.
2. En el caso de levaduras y micobacterias, la bioluminiscencia proporciona un antibiograma fiable en 6 h y 7 días, respectivamente 59,60,

Microfluidos Los avances en nanotecnología han posibilitado que el antibiograma se realice en plataformas o chips que llevan a cabo, utilizando pequeños volúmenes de trabajo, múltiples ensayos que aportan información acerca de la sensibilidad de las bacterias a los antibióticos, como por ejemplo rotura celular, cultivo bacteriano e hibridación y amplificación de ácidos nucleicos, entre otros.

1. Tang et al.61 desarrollaron una plataforma con la que, midiendo los cambios de pH que ocurren como consecuencia de la acumulación de productos metabólicos, es posible detectar el crecimiento bacteriano en 2 h.
2. Mach et al.62 realizaron un antibiograma directamente a partir de muestras de orina utilizando un sistema de microfluidos que incorpora un sensor electroquímico para la cuantificación del ARN ribosómico 16S.

Este grupo obtuvo, en 3 h y media, un 94% de concordancia con respecto a la sensibilidad obtenida mediante microdilución en caldo. Métodos de lisis bacteriana Otra metodología para la determinación de la sensibilidad consiste en la detección de la lisis bacteriana.

1. Para ello, la bacteria es incubada en presencia del antibiótico a la concentración deseada; seguidamente la bacteria se inmoviliza en un microgel de agarosa y es expuesta a una solución de lisis que produce la liberación del ADN.
2. Posteriormente, la preparación es incubada con el fluorocromo SYBR Gold y mediante observación al microscopio de fluorescencia es posible estudiar la integridad del ADN.

Esta metodología proporciona un antibiograma en menos de 2 h 63, A modo de conclusión podemos señalar que las metodologías descritas en esta revisión permiten acortar, respecto a los métodos habituales, el tiempo necesario para determinar la sensibilidad de las bacterias a los antibióticos.

1. Para la interpretación del antibiograma es indispensable conocer la especie bacteriana que se está estudiando.
2. En este sentido, la identificación rápida proporcionada por el sistema MALDI-TOF permite la implementación de las metodologías que realizan un antibiograma rápido.
3. Sin embargo, para determinar si estas técnicas proporcionan una sensibilidad y una especificidad aceptables para la práctica clínica, es necesario ampliar el número de cepas bacterianas y antibióticos estudiados.

Dados los importantes beneficios que se derivan de proporcionar un resultado rápido de sensibilidad de las bacterias a los antibióticos (aumento de la supervivencia, reducción de gastos y retraso de la selección de cepas bacterianas resistentes), se puede afirmar que el antibiograma en Microbiología Clínica, lejos de estar definitivamente establecido, es un campo en continuo avance.

Conflicto de intereses El autor declara no tener ningún conflicto de intereses. Bibliografía G.A. March Rosselló, M.A. Bratos Pérez. Antibiograma rápido en Microbiología Clínica. Enferm Infecc Microbiol Clin, 34 (2016), pp.61-68 M.A. Pence, E. McElvania TeKippe, C.A. Burnham. Diagnostic assays for identification of microorganisms and antimicrobial resistance determinants directly from positive blood culture broth.

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